复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)的病因十分复杂，主要包括遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素、免疫功能异常、血栓前状态、卵巢衰老、孕妇的全身性疾病及环境因素等。RSA是严重危害女性健康及其生命全程包括老年期健康的常见病，病因学复杂，有50%的患者病因不明，因此一直是女性涉及生命全程的保健医学的热点和难点问题之一。妊娠不同时期的RSA，其病因有所不同，妊娠12周以前的早期流产多由遗传因素、内分泌异常、生殖免疫功能紊乱及血栓前状态等所致；妊娠12周至28周之间的晚期流产且出现胚胎停止发育者，多见于血栓前状态、感染、妊娠附属物异常(包括羊水、胎盘异常等)、严重的先天性异常(如巴氏水肿胎、致死性畸形等)；且除此之外，临床上还有近一半的RSA患者原因不明，称为不明原因复发性流产(Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion，URSA)，是临床上难治性疾病之一。该病对患者及其家属的身心健康和生活质量造成了严重损伤，因此，对RSA致病机理研究具有重要的治疗指导意义。本研究进行URSA与抗层粘连蛋白-1抗体的相关性研究，现将具体结果报道如下。 1.资料与方法 1.1 资料来源 URSA组选择2015年1月至2016年12月在北京市友谊医院妇产科复发性流产专科门诊就诊的URSA患者30例，平均年龄31.83岁(24～39岁)，所有患者就诊前均连续自然流产2次以上，流产都发生于妊娠20周以前。URSA的诊断标准：①B超或子宫输卵管碘油造影检查排除子宫畸形或子宫颈机能不全；②子宫颈黏液支原体和衣原体培养排除感染因素；③患者夫妻双方以及流产组织的染色体筛查排除染色体异常；④激素水平测定排除黄体功能不全、高催乳素血症、高雄激素血症以及代谢性疾病、甲状腺功能异常等；⑤自身免疫性疾病相关抗体筛查，包括抗核抗体、抗心磷脂抗体、狼疮抗凝物以及抗可提取核抗原(ENA)抗体均为阴性；⑥患者丈夫的精液检测结果正常。对照组1选择同期156例无不良妊娠史的健康妇女，平均年龄29岁(24～38岁)，对照组妇女均无肝、肾疾病，无自然流产史、早产史、血栓或出血史、妊娠期高血压疾病史，并且至少有1次成功的妊娠分娩史。为保证遗传背景的一致性，所有受试者(包括URSA组和对照组)均来自北京市西城区，签署知情同意书后抽取血液标本。对照组2按照年龄匹配因素，选择同期50例无不良妊娠史的健康妇女作为对照，平均年龄30.90岁(28～35岁)。 1.2 实验方法 1.2.1 应用ELISE方法，层粘连蛋白-1抗体测定[1]：聚丙乙烯板(corning costa 9018)上包被10μg/ml的Laminin-1，体积为100μl/孔，封口，4度孵育过夜[2]。吸走弃去包被液。每孔加入250μlwash buffer，震荡1min，清洗3次[3]。每孔加入200μl的10%的胎牛血清，室温封闭1h[4]。wash buffer洗涤1次[6]。加入100μl梯度标准品或者1:400稀释后的待测血清。并设置至少两个孔的空白。封口，室温孵育2h(或4度孵育过夜，提高灵敏度)[7]。wash buffer洗涤3～5次[8]。加入100μl 1:5000稀释的HRP标记的抗IgG抗体，室温孵育1h[9]。洗涤，每次震荡1～2min，wash buffer洗涤5～7次[10]。加入100μl/孔反应底物TMB，室温孵育15min[11]。每孔加入50μl终止液(stop solution)，在450nm波长及570nm波长检测吸光度，结果用450nm吸光度值减去570nm波长下检测吸光度。 1.2.2 取受试者早晨空腹时肘静脉血5ml，静置1h后，2000r/min离心15min，取血清置于-70℃冰箱保存待测。按照试剂盒说明书应用酶联免疫吸附实验法测定血清中的VEGF(Invitrogen)及s-Flt-1(Invitrogen)浓度。简要步骤为：①用Wash Buffer洗两次Elisa孔；②在所有标准孔中倍比稀释的标准品；③在指定样品孔中加入50μl样品；④向所有孔中加入50μl的Biotin-Conjugate；⑤在室温下(18～25℃)，盖上板子，孵化2h；⑥倒掉所有孔的溶液，Wash Buffer洗板子6次；⑦向所有孔中加入100μl稀释的Streptavidin-HRP，室温下孵育1h；⑧倒掉所有孔的溶液，用Wash Buffer洗板子6次；⑨向所有孔中加入100μl的TMB底物溶液，室温下孵育30min；⑩向所有孔加入100μl Stop Solution；在450nm波长及570nm波长检测吸光度。 1.3 统计学方法 实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差表示，差异性分析采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2.结果 2.1 一般临床资料 2.1.1 由表1可见，两组妇女的年龄没有显著差异(P=0.192)，具有可比性。对照组由于是孕中期的孕妇，因此体重指数明显高于URSA组(P=0.001)。 表1两组一般临床资料比较组别例数(人)年龄(岁)体重指数(kg/m2)健康组5030.90±1.87622.07±2.11URSA组3031.83±3.99223.83±1.74 2.1.2 血清中VEGF与sFlt-1的含量：URSA组血清VEGF浓度为67.14ng/ml，健康对照组VEGF浓度为75.27ng/ml，两组没有显著性差异(P=0.435，见图1)。URSA组血清Frees-Flt-1浓度为193.79pg/ml，健康对照组Free s-Flt-1浓度为336.76pg/ml，URSA组明显低于对照组(P=0.00，见图2)。 图1 URSA组与健康对照组血清中VEGF的比较 图2 URSA组与健康对照组血清中sFlt-1的比较 2.2 经检验，病例组与对照组血清中抗Laminin-1抗体没有统计学差异(P=0.407)，见图3。 图3 3.讨论 3.1 LN-1自身抗体与人类生殖障碍相关性 LN-1是由α1,β1,γ1链组成的异三聚体,最初是由RuperTimp等[1]于20世纪70年代从小鼠EHS肉瘤中分离出来的。其结构为典型的三条短臂和一个长臂组成的“十”字形,每条短臂上都有两个小球形结构，见图4。LN-1属于黏附分子整合素蛋白家族，为细胞外基质的主要成分，是细胞黏附于基质的重要介质，与其受体结合后直接或间接控制细胞活动,如黏附或转移、极化和分化、增殖或凋亡、基因表达及刺激癌细胞产生胶原酶等，并在滋养细胞的黏附、侵入过程中有重要作用。在胚胎种植之前,来自人类早期胚胎的LN-1增加了IV型胶原酶的表达,促进胚胎滋养层在母体着床。LN-1几乎肯定是在发育的胚胎组织中最先表达的层粘连蛋白，因为在鼠发育2～4细胞阶段可以检测到β1、γ1链的mRNA，在桑椹胚阶段就可以检测到α1链的分泌，它掺入到构成滋养外胚层和绒毛膜基底膜中，也使自己和原始的内胚层隔离开。在人类妊娠的前3个月胎盘的胚胎滋养层基底膜检测到的LN-α1链,与基底膜和绒毛外滋养层细胞直接接触。妊娠3个月的胎盘，当绒毛外滋养层细胞形成锚定的胚胎滋养层细胞索时，能够选择性地在绒毛基底膜和增生扩散的胚胎滋养层细胞岛或索发现LN-1的存在。因此认为，LN-1在胚胎滋养层细胞最初黏附并迁移入母体蜕膜过程中可能是必要的[1～3]。 抗LN-1自身抗体首先发现于有习惯性流产史的猴子血清中。该血清能引起培养的鼠胚胎发育异常，进一步研究发现，用鼠LN-1或其LN-1残基免疫猴，猴血清会引起胚胎毒性，不孕或习惯性流产。用兔抗LN-1抗体被动免疫妊娠鼠，能引起自发性流产。定位该抗体，发现其位于来自胚胎的Reicher’s膜和卵黄囊内胚层细胞。临床研究显示，习惯性流产患者血清中的LN-1自身抗体IgG明显升高。而且，其增高与其他IgG自身抗体如β2糖蛋白-1(β2GP1)依赖的抗心磷脂抗体(ACA)、狼疮抗体(LA)、抗DNA抗体、抗核抗体等无关，研究表明，抗LN-1自身抗体与不孕及复发性流产明显相关。结合LN-1在胚胎植入和胎盘形成中的作用，推测抗LN-1自身抗体可能在调节极早期的生殖过程中起作用，影响胚胎的早期发育及种植从而导致不孕[4～7]。 图4 LN-1的模型示意图(α1,β1,γ1链) 3.2 VEGF属于血小板源性生长因子家族，是一种作用于血管内皮细胞的多功能因子，是最有力的促血管新生因子，主要作用是促进血管连接再生，刺激血管内皮细胞的有丝分裂和提高单层内皮的通透性，维持血管内皮细胞存活，并与胎盘因子形成异二聚体，促进胎盘组织的有丝分裂。无论生理和病理环境下，均具有促血管生成的特性。在生理情况下的表达水平很低，而在人体代谢旺盛的组织如胚胎组织、胎盘、增生期子宫内膜和黄体等常高水平表达，以满足生长发育的需要。VEGF受体的可溶性形式sflt-1具有强大的抗血管生成作用,不含酪氨酸激酶结合区域，不能传达活化信号，同时抑制内皮细胞的一氧化氮释放合酶，降低其生物利用度，从而阻断VEGF的生物学功能，成为体内VEGF的天然拮抗剂，引起血管生成障碍并影响血管壁的完整性和通透性。文献报道[8～11],抑制体内sflt-1的生成可以提高妊娠成功率。这一研究首次证明了sflt-1会造成体内VEGF的失衡,引起胎盘功能障碍,导致流产的发生。 3.3 本结果显示：对照组及病例组的血清IL-1滴度无差异。VEGF及其受体的可溶性形式sflt-1，甚至得出相悖的结果，与既往研究结果不同，分析原因可能有以下几点：①本课题组曾成功建立LN-I免疫的流产小鼠模型，证明在动物中抗LN-1抗体确实与流产呈相关性，但在人类中并未得出类似的结论，考虑可能在人类中的年龄、肥胖、基因、环境等都有一定的影响[12～14]。②复发性流产的原因复杂，不能用一种血清学标记物完全解释，尚需探索其他的原因，或者说本研究所涉及的血清学标记物虽然可能解释一部分原因，但是机体是一个复杂的多因素的个体，所以可以解释在某一部分复发性流产的人群中本研究的指标并未成为复发性流产的主要原因，也更加说明复发性流产的复杂性，目前所发现的每一个血清学指标其实都无法完全用单一的原因去解释和治疗。③文献多来自国外文献，也可能存在种族差异、地域差异。总之，RSA是严重危害女性健康及其生命全程包括老年期健康的常见病，病因学复杂，因此阐明其病因一直是女性涉及生命全程的保健医学的关键问题之一。 1 Cha,J.,X.Sun,and S.K.Dey,Mechanisms of implantation:strategies for successful pregnancy.Nat Med,2012.18(12):1754-1767. 2 Zeng F,et al.Gene expression in mouse oocytes and preimplantation embyos:use of suppression subtractive hybridization to identify oocyte and embryo-specific genes[J].Biol Reprod.2013,78:31-39. 3 Li WY,Zhang JK,Yu WD,et al.Expression of stage-specific genes during zygotic gene activation in preimplantation mouse embryos[J].Zool Sci,2003,20(11):1389-1393. 4 Mohan M,Ryder S,Claypool PL,et al.Analysis of gene expression in the bovine blastocyst produced in vitro using suppression-subtractive hybridization[J].Biol Reprod,2002,67(2):447-453. 5 Diatchenko L,Lukyanov S,Lau YF,et al.Suppression subtractive hybridization:A versatile method for identifying differentially expressed genes[J].Meth Enzymol,1999,303:349-380. 6 Salamonsen LA,Nie GY,Findlay JK.Newly identified endometrial genes of importance for implantation[J].J Reprod Immunol,2002,53(1/2):215-225. 7 Lee KF,Kwok KL,Yeung WS.Suppression subtractive hybridization identifies genes expressed in oviduct during mouse preimplantation period[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,277(3):680-685. 8 Fu B，Li X，Sun R，et al.Natural killer cells promote immune toleranceby regulating inflammatory TH17 cells at the human maternal-fetal interface[J].Proc Natl Acad Sci USA，2013，110(3)：231-240. 9 Rizov M,Andreeva P,Dimova I.Molecular regulation and role of angiogenesis in reproduction[J].Taiwan J Obstet Gynecol,2017,56(2):127-132. 10 SM,Bottai H,Arriaga SM.Antiphospholipid and antioangiogenic activity in females with?recurrentmiscarriage and antiphospholipid syndrome.Pelusa HF,Pezzarini E,Basiglio CL,Musuruana J,Bearzotti M,Svetaz MJ,Daniele Ann Clin Biochem.2017 Sep;54(5):577-583. 11 Pelusa HF,Pezzarini E,Basiglio C,et al.ANNALS EXPRESS:ANTIPHOSPHOLIPID AND ANTIOANGIOGENIC ACTIVITY IN WOMEN WITH RECURRENT MISCARRIAGE AND ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME.Annals of Clinical Biochemistry,2016,54(5):0004563216672248. 12 He XP,Chen QF.Reduced expressions of connexin 43 and VEGF in the first-trimester tissues from women with recurrent pregnancy loss[J].Reprod Biol Endocrinol,2016,14(1):46. 13 杨桦.层粘连蛋白-1与子宫内膜异位症复发性流产的相关性研究[J].中国优生与遗传杂志,2012,20(1):121-122. 14 杨桦.抗层粘连蛋白-1抗体与小鼠生殖障碍的相关性研究，《中国生育健康杂志》，2015.26卷，4期，324-326. 15 Maged AM,Abdelhafiz A,Mostafa WA,et al.The role of prophylactic use of low dose aspirin and calheparin in patients with unexplained recurrent abortion[J].Gynecol Endocrinol,2016,32(12):970-972. 复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)的病因十分复杂，主要包括遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素、免疫功能异常、血栓前状态、卵巢衰老、孕妇的全身性疾病及环境因素等。RSA是严重危害女性健康及其生命全程包括老年期健康的常见病，病因学复杂，有50%的患者病因不明，因此一直是女性涉及生命全程的保健医学的热点和难点问题之一。妊娠不同时期的RSA，其病因有所不同，妊娠12周以前的早期流产多由遗传因素、内分泌异常、生殖免疫功能紊乱及血栓前状态等所致；妊娠12周至28周之间的晚期流产且出现胚胎停止发育者，多见于血栓前状态、感染、妊娠附属物异常(包括羊水、胎盘异常等)、严重的先天性异常(如巴氏水肿胎、致死性畸形等)；且除此之外，临床上还有近一半的RSA患者原因不明，称为不明原因复发性流产(Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion，URSA)，是临床上难治性疾病之一。该病对患者及其家属的身心健康和生活质量造成了严重损伤，因此，对RSA致病机理研究具有重要的治疗指导意义。本研究进行URSA与抗层粘连蛋白-1抗体的相关性研究，现将具体结果报道如下。1.资料与方法1.1 资料来源 URSA组选择2015年1月至2016年12月在北京市友谊医院妇产科复发性流产专科门诊就诊的URSA患者30例，平均年龄31.83岁(24～39岁)，所有患者就诊前均连续自然流产2次以上，流产都发生于妊娠20周以前。URSA的诊断标准：①B超或子宫输卵管碘油造影检查排除子宫畸形或子宫颈机能不全；②子宫颈黏液支原体和衣原体培养排除感染因素；③患者夫妻双方以及流产组织的染色体筛查排除染色体异常；④激素水平测定排除黄体功能不全、高催乳素血症、高雄激素血症以及代谢性疾病、甲状腺功能异常等；⑤自身免疫性疾病相关抗体筛查，包括抗核抗体、抗心磷脂抗体、狼疮抗凝物以及抗可提取核抗原(ENA)抗体均为阴性；⑥患者丈夫的精液检测结果正常。对照组1选择同期156例无不良妊娠史的健康妇女，平均年龄29岁(24～38岁)，对照组妇女均无肝、肾疾病，无自然流产史、早产史、血栓或出血史、妊娠期高血压疾病史，并且至少有1次成功的妊娠分娩史。为保证遗传背景的一致性，所有受试者(包括URSA组和对照组)均来自北京市西城区，签署知情同意书后抽取血液标本。对照组2按照年龄匹配因素，选择同期50例无不良妊娠史的健康妇女作为对照，平均年龄30.90岁(28～35岁)。1.2 实验方法1.2.1 应用ELISE方法，层粘连蛋白-1抗体测定[1]：聚丙乙烯板(corning costa 9018)上包被10μg/ml的Laminin-1，体积为100μl/孔，封口，4度孵育过夜[2]。吸走弃去包被液。每孔加入250μlwash buffer，震荡1min，清洗3次[3]。每孔加入200μl的10%的胎牛血清，室温封闭1h[4]。wash buffer洗涤1次[6]。加入100μl梯度标准品或者1:400稀释后的待测血清。并设置至少两个孔的空白。封口，室温孵育2h(或4度孵育过夜，提高灵敏度)[7]。wash buffer洗涤3～5次[8]。加入100μl 1:5000稀释的HRP标记的抗IgG抗体，室温孵育1h[9]。洗涤，每次震荡1～2min，wash buffer洗涤5～7次[10]。加入100μl/孔反应底物TMB，室温孵育15min[11]。每孔加入50μl终止液(stop solution)，在450nm波长及570nm波长检测吸光度，结果用450nm吸光度值减去570nm波长下检测吸光度。1.2.2 取受试者早晨空腹时肘静脉血5ml，静置1h后，2000r/min离心15min，取血清置于-70℃冰箱保存待测。按照试剂盒说明书应用酶联免疫吸附实验法测定血清中的VEGF(Invitrogen)及s-Flt-1(Invitrogen)浓度。简要步骤为：①用Wash Buffer洗两次Elisa孔；②在所有标准孔中倍比稀释的标准品；③在指定样品孔中加入50μl样品；④向所有孔中加入50μl的Biotin-Conjugate；⑤在室温下(18～25℃)，盖上板子，孵化2h；⑥倒掉所有孔的溶液，Wash Buffer洗板子6次；⑦向所有孔中加入100μl稀释的Streptavidin-HRP，室温下孵育1h；⑧倒掉所有孔的溶液，用Wash Buffer洗板子6次；⑨向所有孔中加入100μl的TMB底物溶液，室温下孵育30min；⑩向所有孔加入100μl Stop Solution；在450nm波长及570nm波长检测吸光度。1.3 统计学方法 实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差表示，差异性分析采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1 一般临床资料2.1.1 由表1可见，两组妇女的年龄没有显著差异(P=0.192)，具有可比性。对照组由于是孕中期的孕妇，因此体重指数明显高于URSA组(P=0.001)。表1两组一般临床资料比较组别例数(人)年龄(岁)体重指数(kg/m2)健康组5030.90±1.87622.07±2.11URSA组3031.83±3.99223.83±1.742.1.2 血清中VEGF与sFlt-1的含量：URSA组血清VEGF浓度为67.14ng/ml，健康对照组VEGF浓度为75.27ng/ml，两组没有显著性差异(P=0.435，见图1)。URSA组血清Frees-Flt-1浓度为193.79pg/ml，健康对照组Free s-Flt-1浓度为336.76pg/ml，URSA组明显低于对照组(P=0.00，见图2)。图1 URSA组与健康对照组血清中VEGF的比较图2 URSA组与健康对照组血清中sFlt-1的比较2.2 经检验，病例组与对照组血清中抗Laminin-1抗体没有统计学差异(P=0.407)，见图3。图33.讨论3.1 LN-1自身抗体与人类生殖障碍相关性 LN-1是由α1,β1,γ1链组成的异三聚体,最初是由RuperTimp等[1]于20世纪70年代从小鼠EHS肉瘤中分离出来的。其结构为典型的三条短臂和一个长臂组成的“十”字形,每条短臂上都有两个小球形结构，见图4。LN-1属于黏附分子整合素蛋白家族，为细胞外基质的主要成分，是细胞黏附于基质的重要介质，与其受体结合后直接或间接控制细胞活动,如黏附或转移、极化和分化、增殖或凋亡、基因表达及刺激癌细胞产生胶原酶等，并在滋养细胞的黏附、侵入过程中有重要作用。在胚胎种植之前,来自人类早期胚胎的LN-1增加了IV型胶原酶的表达,促进胚胎滋养层在母体着床。LN-1几乎肯定是在发育的胚胎组织中最先表达的层粘连蛋白，因为在鼠发育2～4细胞阶段可以检测到β1、γ1链的mRNA，在桑椹胚阶段就可以检测到α1链的分泌，它掺入到构成滋养外胚层和绒毛膜基底膜中，也使自己和原始的内胚层隔离开。在人类妊娠的前3个月胎盘的胚胎滋养层基底膜检测到的LN-α1链,与基底膜和绒毛外滋养层细胞直接接触。妊娠3个月的胎盘，当绒毛外滋养层细胞形成锚定的胚胎滋养层细胞索时，能够选择性地在绒毛基底膜和增生扩散的胚胎滋养层细胞岛或索发现LN-1的存在。因此认为，LN-1在胚胎滋养层细胞最初黏附并迁移入母体蜕膜过程中可能是必要的[1～3]。抗LN-1自身抗体首先发现于有习惯性流产史的猴子血清中。该血清能引起培养的鼠胚胎发育异常，进一步研究发现，用鼠LN-1或其LN-1残基免疫猴，猴血清会引起胚胎毒性，不孕或习惯性流产。用兔抗LN-1抗体被动免疫妊娠鼠，能引起自发性流产。定位该抗体，发现其位于来自胚胎的Reicher’s膜和卵黄囊内胚层细胞。临床研究显示，习惯性流产患者血清中的LN-1自身抗体IgG明显升高。而且，其增高与其他IgG自身抗体如β2糖蛋白-1(β2GP1)依赖的抗心磷脂抗体(ACA)、狼疮抗体(LA)、抗DNA抗体、抗核抗体等无关，研究表明，抗LN-1自身抗体与不孕及复发性流产明显相关。结合LN-1在胚胎植入和胎盘形成中的作用，推测抗LN-1自身抗体可能在调节极早期的生殖过程中起作用，影响胚胎的早期发育及种植从而导致不孕[4～7]。图4 LN-1的模型示意图(α1,β1,γ1链)3.2 VEGF属于血小板源性生长因子家族，是一种作用于血管内皮细胞的多功能因子，是最有力的促血管新生因子，主要作用是促进血管连接再生，刺激血管内皮细胞的有丝分裂和提高单层内皮的通透性，维持血管内皮细胞存活，并与胎盘因子形成异二聚体，促进胎盘组织的有丝分裂。无论生理和病理环境下，均具有促血管生成的特性。在生理情况下的表达水平很低，而在人体代谢旺盛的组织如胚胎组织、胎盘、增生期子宫内膜和黄体等常高水平表达，以满足生长发育的需要。VEGF受体的可溶性形式sflt-1具有强大的抗血管生成作用,不含酪氨酸激酶结合区域，不能传达活化信号，同时抑制内皮细胞的一氧化氮释放合酶，降低其生物利用度，从而阻断VEGF的生物学功能，成为体内VEGF的天然拮抗剂，引起血管生成障碍并影响血管壁的完整性和通透性。文献报道[8～11],抑制体内sflt-1的生成可以提高妊娠成功率。这一研究首次证明了sflt-1会造成体内VEGF的失衡,引起胎盘功能障碍,导致流产的发生。3.3 本结果显示：对照组及病例组的血清IL-1滴度无差异。VEGF及其受体的可溶性形式sflt-1，甚至得出相悖的结果，与既往研究结果不同，分析原因可能有以下几点：①本课题组曾成功建立LN-I免疫的流产小鼠模型，证明在动物中抗LN-1抗体确实与流产呈相关性，但在人类中并未得出类似的结论，考虑可能在人类中的年龄、肥胖、基因、环境等都有一定的影响[12～14]。②复发性流产的原因复杂，不能用一种血清学标记物完全解释，尚需探索其他的原因，或者说本研究所涉及的血清学标记物虽然可能解释一部分原因，但是机体是一个复杂的多因素的个体，所以可以解释在某一部分复发性流产的人群中本研究的指标并未成为复发性流产的主要原因，也更加说明复发性流产的复杂性，目前所发现的每一个血清学指标其实都无法完全用单一的原因去解释和治疗。③文献多来自国外文献，也可能存在种族差异、地域差异。总之，RSA是严重危害女性健康及其生命全程包括老年期健康的常见病，病因学复杂，因此阐明其病因一直是女性涉及生命全程的保健医学的关键问题之一。参考文献1 Cha,J.,X.Sun,and S.K.Dey,Mechanisms of implantation:strategies for successful pregnancy.Nat Med,2012.18(12):1754-1767.2 Zeng F,et al.Gene expression in mouse oocytes and preimplantation embyos:use of suppression subtractive hybridization to identify oocyte and embryo-specific genes[J].Biol Reprod.2013,78:31-39.3 Li WY,Zhang JK,Yu WD,et al.Expression of stage-specific genes during zygotic gene activation in preimplantation mouse embryos[J].Zool Sci,2003,20(11):1389-1393.4 Mohan M,Ryder S,Claypool PL,et al.Analysis of gene expression in the bovine blastocyst produced in vitro using suppression-subtractive hybridization[J].Biol Reprod,2002,67(2):447-453.5 Diatchenko L,Lukyanov S,Lau YF,et al.Suppression subtractive hybridization:A versatile method for identifying differentially expressed genes[J].Meth Enzymol,1999,303:349-380.6 Salamonsen LA,Nie GY,Findlay JK.Newly identified endometrial genes of importance for implantation[J].J Reprod Immunol,2002,53(1/2):215-225.7 Lee KF,Kwok KL,Yeung WS.Suppression subtractive hybridization identifies genes expressed in oviduct during mouse preimplantation period[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,277(3):680-685.8 Fu B，Li X，Sun R，et al.Natural killer cells promote immune toleranceby regulating inflammatory TH17 cells at the human maternal-fetal interface[J].Proc Natl Acad Sci USA，2013，110(3)：231-240.9 Rizov M,Andreeva P,Dimova I.Molecular regulation and role of angiogenesis in reproduction[J].Taiwan J Obstet Gynecol,2017,56(2):127-132.10 SM,Bottai H,Arriaga SM.Antiphospholipid and antioangiogenic activity in females with?recurrentmiscarriage and antiphospholipid syndrome.Pelusa HF,Pezzarini E,Basiglio CL,Musuruana J,Bearzotti M,Svetaz MJ,Daniele Ann Clin Biochem.2017 Sep;54(5):577-583.11 Pelusa HF,Pezzarini E,Basiglio C,et al.ANNALS EXPRESS:ANTIPHOSPHOLIPID AND ANTIOANGIOGENIC ACTIVITY IN WOMEN WITH RECURRENT MISCARRIAGE AND ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME.Annals of Clinical Biochemistry,2016,54(5):0004563216672248.12 He XP,Chen QF.Reduced expressions of connexin 43 and VEGF in the first-trimester tissues from women with recurrent pregnancy loss[J].Reprod Biol Endocrinol,2016,14(1):46.13 杨桦.层粘连蛋白-1与子宫内膜异位症复发性流产的相关性研究[J].中国优生与遗传杂志,2012,20(1):121-122.14 杨桦.抗层粘连蛋白-1抗体与小鼠生殖障碍的相关性研究，《中国生育健康杂志》，2015.26卷，4期，324-326.15 Maged AM,Abdelhafiz A,Mostafa WA,et al.The role of prophylactic use of low dose aspirin and calheparin in patients with unexplained recurrent abortion[J].Gynecol Endocrinol,2016,32(12):970-972.